Метаболизм пирувата в клетке

научная статья по теме ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИТАМИНОВ НА СИНТЕЗ ЛАКТАТА, ЭТАНОЛА, ПИРУВАТА И ЭТИЛАЦЕТАТА В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ DIPODASCUS MAGNUSII Биология

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИТАМИНОВ НА СИНТЕЗ ЛАКТАТА, ЭТАНОЛА, ПИРУВАТА И ЭТИЛАЦЕТАТА В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ DIPODASCUS MAGNUSII»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 4, с. 483-489

ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИТАМИНОВ НА СИНТЕЗ ЛАКТАТА, ЭТАНОЛА, ПИРУВАТА И ЭТИЛАЦЕТАТА В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ

© 2008 г. А. П. Ильченко1, В. А. Щербакова

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская обл.

Поступила в редакцию 23.04.2007 г.

Установлено, что при выращивании на глюкозе ауксотрофных по тиамину и биотину дрожжей Di-podascus magnusii при избыточной концентрации тиамина метаболизм пирувата направлен на синтез продуктов брожения — этанола и, в меньшей степени, лактата. В этих же условиях наблюдался значительный синтез этилацетата. Внесение в среду никотиновой кислоты (НК) приводило к разделению во времени процессов образования этанола и лактата. Показано, что выращивание дрожжей в условиях дефицита биотина приводило к практически полному подавлению аэробного образования этанола, прекращению синтеза этилацетата, тогда как синтез лактата активировался уже в первые часы культивирования. При внесении в этих условиях НК концентрация лактата резко увеличивалась. Полученные результаты показывают, что сочетанием тиамина и биотина с другими витаминами можно стимулировать использование пула пирувата у дрожжей в сторону образования значительных количеств лактата, что характерно только для клеток высших эукариот и бактерий.

Ключевые слова: дрожжи, Dipodascus magnusii, брожение, пируват, лактат, этанол, этилацетат.

Ранее отмечалось, что регуляция деградации глюкозы в дрожжах и опухолевых клетках очень схожи во многих аспектах [1]. В обоих случаях это приводит к экскреции конечных продуктов брожения: в первом — этанола, во втором — лактата. Гомология деградации глюкозы между дрожжами и опухолевыми клетками прослеживается как на уровне цикла деления клеток, сигнала трансдук-ции, так и регуляции ключевых гликолитических ферментов. Было установлено, что экскреция этанола дрожжами и лактата опухолевыми клетками, соответственно, есть результат избыточной активности ферментов в точке образования пирувата [1]. В то же время, основным различием между этими процессами является неспособность дрожжей образовывать заметные количества лактата.

С другой стороны, промышленное использование лактата для синтеза соответствующего полимера, вызвало значительный интерес к изучению возможности его метаболического синтеза дрожжевыми организмами, более кислотоустойчивыми, чем молочнокислые бактерии. С этой целью через делецию трех генов, кодирующих пируват-декарбоксилазу, и введения гетерологичной лак-татдегидрогеназы (КФ 1.1.1.27) был сконструирован штамм Saccharomyces cerevisiae. Инкубация такой аэробной культуры, выращенной в условиях

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: [email protected]).

хемостата, с избытком глюкозы приводила к быстрому появлению лактата как основного продукта брожения. В то же время данный штамм не рос в анаэробных условиях, а образование лактата при всех условиях культивирования было ниже, чем спиртовое брожение у дикого штамма [2].

В данной работе мы попытались исследовать возможность синтеза лактата дрожжами О1ройа8-еш magnusii при выращивании их на глюкозе в зависимости от концентрации тиамина и биотина, по которым данная культура ауксотрофна, а также изучить влияние никотиновой кислоты на этот процесс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культура. В качестве объекта исследований были выбраны дрожжи Dipodasеus magnusii ВКМ У-1072.

Среда и условия культивирования. Культивирование дрожжей проводили в колбах объемом 750 мл (объем среды 50 мл) на качалке и в ферментерах объемом 3 л (объем среды 1.5 л) на минеральной среде Ридер с добавлением смеси микроэлементов по Буркгольдеру, рН 5.5 и температуре 29°С. Концентрацию витаминов — биотина, тиамина и никотиновой кислоты (НК) варьировали в зависимости от целей и задач эксперимента. Концентрацию кислорода в ферментере поддерживали

Рис. 1. Метаболизм пирувата в клетках эукариот. ПДК — пируватдекарбоксилаза, ТА — трансаминазы, ПК — пируват-карбоксилаза, ПД — пируватдегидрогеназа, ЛДГ — лактатдегидрогеназа, АДГ-1 — классическая алкогольдегидрогена-за, Bi — тиамин, Bg — пиридоксин, НК — никотиновая кислота, Bio — биотин, ПА — пантотеновая кислота, ЩУК — окса-лоацетат, АцетАл — ацетальдегид.

на уровне р02 = 20{56b2140a1523f4d2d45871e40561ef1e7c03c51817328c7f38bddfcacd698f9d} от насыщения. В качестве источника углерода использовали 5{56b2140a1523f4d2d45871e40561ef1e7c03c51817328c7f38bddfcacd698f9d} глюкозы. Исходная концентрация ионов NH+ = 45 ± 5 мМ.

Аналитические методы. Концентрацию глюкозы определяли, используя набор стандартных реагентов (ЗАО «Диакон-ДС»). Метод основывается на окислении глюкозы глюкозооксидазой с образованием эквимолярных количеств перекиси, которая реагирует с хромогенными соединениями (к 480-520 нм).

Содержание аммония измеряли ион-селективным электродом фирмы «Orion».

Этанол определяли полярографически по потреблению кислорода в присутствии аликвоты куль-туральной жидкости и метанолоксидазы, выделенной из дрожжей Hansenula polymorpha [3].

Содержание этилацетата в культуральной жидкости анализировали на газовом хроматографе Pye-Unicam c пламенно-ионизационным детектором. Для этого использовали стеклянную колонку длиной 2 м и внутренним диаметром 2 мм, заполненную Хромосорбом W/AW-DMCS, 100-200 меш («Fluka»), покрытым 20{56b2140a1523f4d2d45871e40561ef1e7c03c51817328c7f38bddfcacd698f9d}-ным неопентилгликоль-сукцинатом. Температуру колонки поднимали с 80 до 175°C со скоростью 6°С/мин. Температура инжектора и детектора составляла 140 и 180°С соответственно. В качестве газа-носителя использовали азот со скоростью подачи 20 мл/мин.

Для измерения содержания пирувата в культуральной жидкости клетки отделяли от среды центрифугированием (14000 g, 5 мин), белки осаждали добавлением равного объема 6{56b2140a1523f4d2d45871e40561ef1e7c03c51817328c7f38bddfcacd698f9d}-ной хлорной кислоты. Осадок удаляли центрифугированием (14000 g,

15 мин), а супернатант использовали для анализа. Концентрацию пирувата определяли с помощью изократической ВЭЖХ на колонке Aminex HPX-87H, 300 х 7.8 мм «Bio-Rad». В качестве подвижной фазы использовали 4 мМ H2SO4. Скорость элюции составляла 0.5 мл/мин, температура 35°С, детекция -при 206 нм. Для построения калибровочной кривой использовали набор стандартов фирмы «Bio-Rad».

Концентрацию лактата определяли спектрофо-тометрически, используя набор реактивов фирмы «Лахема». Определение основано на восстановлении НАД до НАДН при окислении лактата лактатдегид-рогеназой (КФ 1.1.1.27).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время накопление лактата рассматривается как метаболический тупик в том смысле, что он может образовываться или утилизироваться только через пируват. В тканях высших эукариот его образование определяется главным образом концентрацией пирувата и степенью восстановленности пиридиннуклеотидов (ПН). Поэтому при постановке экспериментов мы руководствовались схемой метаболизма пирувата в клетках эукариот (рис. 1). Из приведенной схемы следует, что процессы синтеза лактата и этанола конкурентны в отношении НАДН, а также способности (или неспособности) пируватдегироге-назного комплекса при избытке образующегося в гликолизе или при переаминировании (дезамини-ровании) аминокислот пирувата направлять его на восстановление до лактата или на декарбоксили-рование до ацетальдегида, либо в цикл Кребса.

Влияние концентрации глюкозы и тиамина на аэробное брожение

Кофактором пируватдегидрогеназного комплекса является тиаминпирофосфат (рис. 1), поэтому мы провели исследования гликолитической части метаболизма глюкозы в зависимости от концентрации тиамина.

Оказалось, что при выращивании исследуемых дрожжей при исходной концентрации глюкозы 5{56b2140a1523f4d2d45871e40561ef1e7c03c51817328c7f38bddfcacd698f9d} и концентрации тиамина 1 мг/л в культуральной среде обнаруживается значительные количества основных продуктов брожения — этанола и лактата (рис. 2), а также их источника — пирувата. Максимальные концентрации конечных продуктов брожения достигались при переходе культуры в стационарную фазу роста, вызванную исчерпанием источника азота.

Следует сразу отметить, что во всех случаях экскреции этанола и лактата в среду всегда предшествует появление в ней 2-4 мМ пирувата. Вероятно, его реальная концентрация может быть значительно выше, так как известно, что пируват легко переходит в метилглиоксаль [4], быстро полимеризующийся в димер. Полученные результаты показывают, что равновесие в использовании пула пирувата сильно сдвинуто в сторону образования этанола (до 300 мМ), а не лактата (8-10 мМ).

Изучение влияния концентрации глюкозы на концентрацию экскретируемого в первые часы культивирования (7-9 ч) пирувата показало, что она пропорциональна ее исходной концентрации (данные не приводятся). В то же время концентрация этанола и лактата зависела как от концентрации источника углерода, так и от концентрации тиамина. При более высоких концентрациях тиамина сдвиг в сторону образования продуктов брожения значительно возрастал (данные не приводятся). Следует отметить, что еще ранее «сбой» метаболизма в сторону брожения у дрожжей Endomyces magnusii при выращивании в аэробных условиях на сбраживаемых субстратах (сахароза) при избытке тиамина отмечался и другими исследователями [5, 6].

Однако этими двумя основными продуктами брожения не ограничивается спектр экскретируе-мых в этих условиях продуктов (рис. 26). Видно, что параллельно накоплению в среде этанола увеличивается и выброс ацетата, который может быть производным как этанола (альдегиддегидро-геназная реакция), либо пируватдегидрогеназного комплекса (при лимите по АТФ). Более того, в среде начинается синтез одного из летучих производных этанола — этилацетата, концентрация которого возрастает по мере падения концентрации этанола и ацетата. Как полагает ряд исследователей [7, 8], биосинтез этого токсичного соединения происходит из этанола и ацетил-КоА при избыточном содержании АТФ в клетке.

naukarus.com

А также:

Как сделать рост мышц : Молочная кислота в мышцах бодибилдинг : Тяжелая атлетика тренировки для детей : Не могу набрать вес парню : Как увеличить скорость роста мышечной массы :